【实验目的】

（1）掌握割胶回收外源DNA的原理。

（2）掌握琼脂糖凝胶电泳割胶回收外源DNA片段的方法及操作步骤。

【实验原理】

DNA经琼脂糖凝胶电泳后，切下要回收的含DNA的琼脂块，采用DNA胶回收试剂盒回收DNA。DNA胶回收试剂盒包括DNA凝胶熔化液、DNA洗涤液和DNA洗脱液。其原理是：琼脂糖凝胶块在凝胶熔化液（溶液Ⅰ）中被迅速熔化并释放出DNA，DNA片断被选择性吸附到硅胶膜上，经DNA洗涤液（溶液Ⅱ）洗涤去除残留在硅胶膜上的杂质和高浓度盐离子后，吸附到硅胶膜上的DNA片断经微量水或DNA洗脱液（溶液Ⅲ）洗脱下来。该方法回收率高且不降解DNA，操作简单、快速、方便，纯化的DNA适合于任何分子生物学操作（如酶切、克隆、测序等）。此方法也适用于去除盐、有机溶剂、未反应的寡核苷酸、引物、引物二聚体标记或PCR反应中的酶。

【实验材料、试剂及仪器】

1．实验材料

PCR扩增产物50μL，或酶切后释放小片段DNA的重组质粒。

2．实验试剂

DNA胶回收试剂盒：购自上海生工生物工程技术服务有限公司。试剂盒中包括凝胶熔化液（溶液Ⅰ）、DNA洗涤液（溶液Ⅱ）和DNA洗脱液（溶液Ⅲ）。

3．实验仪器

台式高速离心机（每8人1台）

恒温水浴锅（每8人1台）

1．5mL无菌离心管（每人4支）

移液器（每2人1套）

200μL、1mL无菌吸头（若干）

【实验步骤】

（1）1.4％琼脂糖凝胶电泳（教师完成）。

（2）用手术刀将目的DNA片段的琼脂块割下，称量琼脂块的重量。

（3）将琼脂块放在离心管内用1mL枪头捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ（如胶为100mg，则加100μL溶液Ⅰ），颠倒混匀，50～60℃水浴加热约10min至胶全熔。其间，需颠倒混匀三四次，以加速凝胶熔解。如果胶碎片较小，3～5min即可全熔；凝胶碎片较大，则需较长时间，胶全熔后至少再50～60℃水浴加热2min。

（4）将胶加入到DNA纯化柱内，室温放置1min后，最高速（16000g左右）离心1min，倒弃收集管内的液体。（注：这一步一定要达到16000g，较低离心速度会导致回收效率下降。）

（5）在DNA纯化柱内加入700μL溶液Ⅱ，室温放置1min后，最高速离心1min，洗去杂质，倒弃收集管内的液体。

（6）再加入500μL溶液Ⅱ，最高速离心1min，进一步洗去杂质，倒弃收集管内的液体。最高速再离心1min，除去残留液体，并让残留的乙醇充分挥发。

（7）将DNA纯化柱置于1.5mL离心管上，加入30μL溶液Ⅲ至管内柱面上，放置5min后，最高速离心1min，所得液体即为高纯度DNA。

【实验注意事项】

（1）进行步骤（4）时，如果样品体积较大，DNA纯化柱内容纳不下，可以先把部分样品加入到纯化柱内，经离心处理后，再加入剩余的样品继续处理。

（2）进行步骤（7）时，溶液Ⅲ需要直接加至管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收（如果不慎将溶液Ⅲ沾在管壁上，一定要震动管子，使液体滑落到管底，以便被纯化柱吸收。也可用重蒸水或MiliQ级纯水替代溶液Ⅲ，但是水的pH应不小于6.5），再放置较长时间（如3～5min），会对提高产量略有帮助。

【典型实验结果分析】

图11.3琼脂糖凝胶回收DNA片段M：DNA分子大小标准参照物；1：纯化后的PCR产物

理想实验结果（见图11.3）

得到与预期大小一致的目的片段，条带清晰，无杂质。

【实验讨论】

问题1：琼脂糖凝胶的多少对实验结果有无影响？

答：采用熔胶法来纯化DNA时，必须将琼脂糖凝胶完全熔解。因此，若琼脂糖凝胶量过多，不仅增加了熔胶液的用量，而且不利于凝胶的完全熔解，会影响后续的操作；若凝胶量过少，则所含的DNA量就少，获得的DNA量也少。

问题2：本实验对DNA的量有无限制？

答：DNA纯化柱对所结合的DNA量有一定的限制，因此，采用此方法时，DNA的量不可过多，也不可过少。若DNA量过少，则达不到DNA纯化柱的最大结合量，浪费了DNA柱子；若DNA的量过多，则超出了DNA纯化柱的最大结合量，减少了DNA得率。